Nat Commun︱前沿! 宋源泉团队揭示抑制轴突再生的新分子机制
撰文︱王培香
责编︱王思珍
由于成熟神经元的再生潜能降低和细胞微环境的抑制，成年中枢神经系统（CNS）的轴突再生受到限制，所以，成年个体一旦发生脊髓损伤或患有中风，其往往出现一些永久性的残疾【1-3】。然而，与CNS不同，通常外周神经系统（PNS）在受损后能够进行轴突再生和功能恢复，但是，当受到一些严重的外周损害后，比如近端神经的病变或完全横断，PNS自发轴突再生速度减慢、神经再生失败，或诱发慢性疼痛，PNS依然出现神经功能缺陷【4】。而且PNS的再生能力也会随着个体衰老而逐渐下降【5】。因此，为了改善成年哺乳动物CNS和PNS受损后的功能，需要策略来提高轴突再生的速率和程度。为了实现这一目的，研究的主要焦点之一：即揭示诱导再生或抑制再生的内源性分子机制。
Atr是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其能感知DNA单链断裂（SSB），并通过磷酸化Chek1（检查点激酶1）而激活DNA损伤检查点。Chek1进而磷酸化并抑制磷酸酶Cdc25（细胞分裂周期蛋白25），继而阻止Cdk1/CycB（周期蛋白依赖性激酶1/周期蛋白B）的去磷酸化，从而导致细胞周期阻滞在G2/M期或S期【6, 7】。
Atr也可以通过如渗透应力等机械刺激被激活【8】，但是其潜在的机械感受器未知。机械敏感离子通道Piezo在轴突再生过程中被激活，导致局部钙瞬态的升高和一氧化氮合酶（Nos）级联反应的激活，以限制轴突再生【9】。Piezo功能丧失促进第III类da神经元轴突再生。但是Piezo-Nos的下游分子信号并不清楚。那么，Atr-Chek1是否作用于Piezo-Nos的下游从而调节轴突再生呢？
2021年6月22日，美国宾夕法尼亚大学费城儿童医院的宋源泉课题组在Nature Communication上发表了题为“The Atr-Chek1 pathway inhibits axon regeneration in response to Piezo-dependent mechanosensation ”的研究论文。他们发现，Atr-Chek1及相关的DNA损伤检查点位复合体位于Piezo下游，以抑制轴突再生。值得注意的是，独立于典型的DNA损伤，Atr通过机械敏感离子通道Piezo（作为机械传感器）及其下游一氧化氮 （作为调节子）以响应再生过程中引起的机械刺激。阻断Atr-Chek1可促进PNS和CNS轴突再生，导致突触再生和行为恢复。该研究揭示了Atr-Chek1激酶级联在调节神经再生方面发挥了意想不到的作用，及其与机械敏感离子通道Piezo之间的机制联系，这为刺激神经再生提供了潜在的治疗靶点。
在之前的研究中，该课题组建立了果蝇外周感觉神经元损伤模型。采用双光子激光对果蝇树突分枝（da）感觉神经元的轴突进行损伤，da神经元表现出细胞类型特异性的再生：IV类da神经元可以再生，但III类da神经元不能再生【10】。在此项研究中，作者进行了介导轴突再生的其他细胞应激通路的筛选，重点关注了DNA损伤反应（DDR）通路分子，并发现，介导SSB反应的分子可特异性的抑制轴突再生。
首先，在III类da神经元进行功能丧失（LOF）实验。敲降或无效突变果蝇Atr同源物mei41可以明显促进III类da神经元的轴突再生。证明mei41的作用是细胞自主性的。在III类da神经元中敲降或无效突变果蝇Chek1同源物grp，也有类似的轴突再生增强。另一方面，在III类da神经元中特异性过表达果蝇Cdc25C/Cdc25A同源物twe或stg（受Chek1负调控），可促进轴突再生。已知Cdc25通过去除酪氨酸15（Y15）和相邻苏氨酸（T14）残基的抑制性磷酸化来激活Cdk1。因此，在III类da神经元中过表达Cdk1的磷酸受体突变体（不能被磷酸化，一直处于活化形式），足够诱导轴突再生。而且，敲降Cdc25/twe可抵消mei41突变体的再生增强，说明Cdc25/twe位于mei41的下游。
接着在IV类da神经元进行获得功能（GOF）实验。在IV类da神经元过表达野生型人类ATR（hATR-WT）可显著降低轴突再生，而过表达激酶失活的hATR（hATR-KD）不能改变再生，表明Atr的激酶活性是抑制轴突再生必需的。相应地，在IV类da神经元过表达Chek1/grp或人类CHEK1可以减少轴突再生。这表明，Atr-Chek1介导轴突再生的功能是保守的。而且，Cdc25/twe敲降或Cdk1突变都可以在同样程度上阻碍轴突再生。最后，当与组成型激活的Cdk1（T14A，有Y15F）共表达，hATR-WT不能抑制再生，证明Cdk1在Atr的下游发挥作用。这些LOF和GOF实验证明：Atr-Chek1通路调节神经再生，Atr/mei41-Chek1/grp抑制再生，Cdc25/twe-Cdk1促进再生（图1）。
图1 Atr/mei41-Che1/grp通路调控果蝇感觉神经元轴突再生
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
作者接下来检测了Atr/mei41基因的表达模式，发现mei41表达于III类da神经元的细胞核，其表达水平和分布在受损前后没有明显差异。mei41也表达于其他类型的da神经元，表明Atr/mei41本身可能不是再生细胞类型特异性的决定因素。作者检测了另一个经典的由双链DNA断裂（DSB）触发的DDR分支，发现其不参与调控轴突再生，表明 Atr-Chek1通路在调节再生中的特异性，也提出了DNA损伤是否确实涉及的问题。
由此，第二个问题：在神经再生过程中DNA损伤是否参与了Atr激活？首先，通过检测p-His2Av（DNA损伤标记），作者发现，在da感觉神经元的神经损伤和轴突再生过程中并没有诱发明显的DNA损伤。第二，在于III类da神经元敲降His2Av没有增加轴突再生。第三，阻断ssDNA的感知步骤，即在III类da神经元敲降或敲除复制蛋白A（RPA）的各个亚基（RPA识别DNA单联损伤，并吸引Atr结合），也均没有增强轴突再生。最后，在IV类da神经元过表达RPA的3个亚基，也没有抑制轴突再生。这些数据表明：Atr-Chek1通路抑制轴突再生，而不依赖于其在DNA损伤中的典型作用（图2）。
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
响应DNA损伤的Atr检查点激活包含以下几个步骤：DNA损伤的感知、信号转导和执行。既然RPA介导的DNA损伤感知步骤没有参与神经再生，那么其他两个步骤的因子是否参与调节呢？对检查点复合物的其他因子如Atrip/mus304，Rad17， Rad1，TopBP1/mus101，Claspin，Hus1-like进行敲降或敲除，发现均可以显著促进III类da神经元的轴突再生。这些数据表明：DNA损伤信号转导的检查点复合物对促进Atr-Chek1抑制神经再生的作用至关重要（图3）。
图3 Atr相关检查点复合物抑制轴突再生
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
轴突再生只是修复神经连接的第一步。真正的修复需要再生轴突找到它们的目标并重新形成功能性突触。为了评估果蝇的功能恢复，作者采用了一种基于幼虫轻触反应的行为范式，用睫毛轻触幼虫的前段，即胸（T）段和第一腹部（A1）段，可以得到一组容易量化的典型反应。如前所述，机械敏感的III类da神经元介导轻柔的触觉，它们进入腹侧神经干（VNC）。T1段的轴突组成VNC最前面的T1束，T2段的轴突组成VNC的T2束。损伤T1或T2束仅仅特异性地损害T1或T2段的触觉反应。野生型果蝇的T1或T2束受损后，导致T1和T2段的轻触反应丧失，而不影响T3和A1节段，该缺陷可持续48h或更久。作者评估了抑制Atr-Chek1通路后的行为结果。敲降mei41、敲除Rad17和mus101的均显示出功能恢复。这些数据表明：抑制Atr-Chek1通路不仅有利于轴突再生，而且促进功能再生（图4）。为了进一步评估功能性的突触再生，首先作者确定了CNS中III类da神经元能够形成胆碱能突触。其次作者消融了VNC一侧的III类神经元轴突束，并观察到，其在8h内从神经纤维网中缩回，24h后，野生型轴突很少长回神经纤维网，而mus101突变体不仅显示出广泛的轴突（~50%）再生到神经纤维网，而且突触的重组也增加了。这些数据表明：抑制Atr-Chek1通路促进功能性突触的重组（图5）。
图4 抑制Atr相关检查点复合体组分可促进果蝇CNS损伤后的行为恢复
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
图5 抑制Atr通路促进果蝇突触再生。
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
前面已经证明在神经再生过程中，DNA受损不是Atr的激活因素，那么，激活因素究竟是什么呢？基于已有的证据，作者猜想，机械性刺激可能是诱导因素，机械性刺激经Piezo传导从而激活Atr-Chek1通路。为了验证该猜想，首先，作者试图确定Atr对渗透压力的响应是否是依赖Piezo。当PIEZO1被敲除后，低渗应激诱导的Atr聚集减弱了。Nos位于Piezo的下游。抑制NOS可减弱低渗应激诱导的ATR聚集，而激活NOS可挽救PIEZO1KO减少的ATR聚集。这些结果表明：机械应激诱导的Atr重新定位依赖于Piezo和Nos的存在，而且Piezo可以作为Atr对机械性刺激反应的机械感受器（图6）。第二步，作者通过遗传互作和上位效应分析，发现，Atr/mei41在Piezo-Nos的下游起作用，并且Atr/mei41可以覆盖Piezo或Nos去除后产生的再生表型（图7 a-c）。第三步，在III类da神经元受损后，62.5%的野生型III类da神经元在轴突尖端周围、沿轴突和细胞体中均观察到明显的NO生成，而PiezoKO的NO生成受到抑制（图7 d-g）。综合说明：NO作为关键信使分子，在轴突再生过程中将Piezo通道的激活与下游Atr-Chek1通路关联起来（图7）。（补充：一对基因显性基因的表现受到另一对非等位基因的作用，这种非等位基因间的抑制或遮掩作用叫上位效应。起抑制作用的基因称为上位基因，被抑制的基因称为下位基因【11】。）
图6 ATR对渗透胁迫的响应依赖于PIEZO1和NOS
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
图7 在抑制轴突再生和NO显像过程中，Atr/mei41在Piezo和Nos下游发挥作用
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
在确定了hATR和hCHEK1抑制果蝇轴突再生后，作者推测，Atr-Chek1在哺乳动物中也可能发挥再生抑制剂的功能。他们在体外培养的大鼠背根神经节（DRG）神经元测试了Atr和Chek1抑制剂促进轴突再生的功效，发现，Atr的两种药理抑制剂AZD6738和VE-822，Chek1抑制剂MK-8776都能适度促进轴突再生。不仅如此，将抑制剂MK-8776在轴突损伤后立即注射到果蝇幼虫，发现该化合物显著提高了III类神经元的轴突再生，说明在果蝇体内抑制Chek1也可以促进再生。感觉神经元Atr条件性敲除（cKO）小鼠在坐骨神经受损后，其神经再生明显增加。另一方面，在DRG神经元中过表达CHEK1减少了轴突再生。总之，Atr-Chek1通路在哺乳动物神经元中也具有抑制轴突再生的内在作用，这一过程可能在进化上是保守的，靶向Atr-Chek1的抗癌药物可能被用于治疗神经损伤（图8 a-j）。
图8 通过药物抑制剂或条件敲除抑制Atr通路，可促进体外和体内哺乳动物DRG神经元轴突再生，以及轴突在不同刚性底物上的生长
（图片引自：Li, F., Lo, T.Y., Miles, L. et al. Nat Commun 2021; 12: 3845）
为了了解Piezo在轴突再生过程中是如何被激活的，作者试图知道细胞外基质的硬度是否会在Piezo存在或不存在的情况下影响轴突的生长。在不同硬度的聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶基质上培养成年小鼠DRG神经元，通过测量神经突的长度找出Piezo最有可能发挥其抑制作用的硬度范围。结果发现，在硬度为5.0或30.0 kPa水凝胶上生长时，对照组和Piezo1 cKO组之间的神经突总生长没有差异，而在0.3 kPa或1 kPa水凝胶上，Piezo1 cKO组神经元的神经突总长度明显高于对照组神经元，说明Piezo1更容易在相对较软的基质上被激活。下游Atr cKO神经元的表现与Piezo1 cKO组相似。因此，在轴突再生过程中，轴突尖端与外界环境之间的局部作用力可能在Piezo1激活范围内，激活后的Piezo1能够将物理刺激从生长锥传递到细胞内从而来减缓轴突再生（图8k-m）。
在本研究中，不依赖于DNA损伤，Atr-Chek1通路是轴突再生的神经元内在负调节因子。其具体机制为：在轴突再生过程中，生长锥与胶质细胞等环境相互作用，导致生长锥顶端机械敏感离子通道Piezo的激活，Piezo的打开导致局部钙内流和Nos的激活，从而产生NO；NO作为第二信使并传播到细胞核，激活Atr及其相关复合物，然后Atr磷酸化并激活chek1，chek1磷酸化并失活Cdc25，抑制其去磷酸化及激活Cdk1的能力；失活的Cdk1影响下游效应因子，最终导致神经再生失败。
此外，Piezo-Nos-Atr机制不仅能抑制果蝇幼虫的轴突再生，还能抑制小鼠的成年感觉神经元，这些发现表明了Atr途径在调节再生过程中的作用是保守的。
作者建立了一种基于果蝇触觉的行为范式，用于评估中枢神经系统损伤后的功能再生，并且发现抑制Atr-Chek1通路对突触再生和功能恢复具有促进作用。
当然，本实验也有不足。例如，NO是如何激活下游的Atr？Atr是否本身能够感受到机械刺激？胶质细胞很可能影响了环境的硬度，但是本文没有涉及这方面的内容。
原文连接： https://doi.org/10.1038/s41467-021-24131-7
李丰（后排左二）、Tsz Lo（前排右二）、Leann Miles（前排左二）及王骎（前排右一）为共同第一作者，宋源泉（前排左一）为通讯作者
（图片来源：宋源泉实验室）
宋源泉团对长期致力于神经再生和儿童神经发育性疾病研究，工作成果相继发表于Cell Metabolism, Neuron, Nature Communications, Science Advances, American Journal of Human Genetics, Genes & Development, eLife等知名期刊。实验室热诚欢迎志同道合者加盟，博士后岗位长期开放，待遇从优。有意者联系songy2@chop.edu。
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制版︱王思珍
本文完